酶聯免疫吸附試驗( enzyme-linked immunosor-bent-assay，ELISA) 因其敏感度高、特異性強、操作簡單、重復性好而且不需要昂貴的儀器而得到廣泛使用，但ELISA 測定中影響因素很多，而且操作中有一定的技術要求，在臨床檢驗中如果處理不當，會出現一些錯誤結果( 假陽性和假陰性) 。現就ELISA 實驗中經常碰到的異常結果予以分析，供大家參考。
1 異常結果分析
1． 1 白板顯色步驟結束后，酶標板所有孔均無顏色。可能是試劑已過有效期或不同試劑盒組分混用，錯加、漏加試劑組分，洗板及加樣過程中，酶標受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力所致。
1． 2 顯色弱、靈敏度低
1． 2． 1 未按說明書要求操作實驗結束后，包括陽性對照、質控在內的所有板孔顏色均較淡。原因是:①超過有效期的產品可能會產生很弱的信號。②試劑、樣品在使用前未平衡至室溫。③加入試劑的體積和時間( 順序) 有誤。④洗板和加樣過程中，酶標受污染失活催化顯色劑顯色的能力所致，或顯色液受污染。⑤孵育時間及孵育溫度未達到要求。⑥洗板次數過多，或濃縮洗液稀釋倍數不符合要求，或用其他廠家洗液洗板，導致靈敏度低。
1． 2． 2 標本含有防腐劑實驗結束后，陰性與陽性對照正常，質控正常，但標本顯色較弱。原因是:①待測標本中可能不含強陽性標本，故結果可能是正常。②標本加入疊氮鈉作為防腐劑。
1． 2． 3 標本或質控品保存、孵育不當實驗結束后，陰性與陽性對照正常，但質控、個別弱陽性標本沒能檢出。原因是: ①未達到要求的孵育溫度及孵育時間可檢出強陽性標本，但質控或弱陽性標本受溫度變化影響較大而未被檢出。②質控品或標本高溫放置過久被反復凍融，以致待測物滴度下降，而未被檢出。③儀器設定不正確，或濾光片不匹配。
1． 2． 4 酶標儀參數不對實驗終止后，目測結果正常，但酶標儀讀數結果偏低。可能是酶標儀設定不正確或濾光片不匹配。
1． 3 靈敏度過高、板底高、高背景
1． 3． 1 花板實驗終止后，整板結果呈現均一的黃色或淡黃色，或陰陽性對照、質控正常，陰性標本OD值過高。原因是: ①整板的黃板現象可能是由于錯加其他試劑造成。②酶標對吸頭的污染以及對盛放顯色劑容器的污染都易造成黃板現象。③孵育溫度過高或孵育時間過長。④未按要求洗板，用自來水或其他公司洗液洗板，特別是洗液時每孔未注滿洗液，易造成花板黃板現象。⑤陰陽性對照、質控正常，陰性標本OD 值過高的情況稱為花板，一般是由于標本的收集、處理和保存方法不當，洗板不切底、顯色時間延長造成［1］。
1． 3． 2 跳孔出現隨機性的花板、跳孔現象。原因是: ①加樣時交叉污染。②手工洗板造成的交叉污染。③洗板機某幾個加液頭堵塞導致花板、跳孔。④拍板時交叉污染。
1． 4 假陽性出現假陽性的原因有: ①計算Cutoff值時使用的公式不正確，導致計算得出的Cutoff 值過低，從而導致出現假陽性。②洗板時板孔未能注滿洗液，或洗板次數、浸泡時間不夠，用其他公司洗液洗板，導致花板、跳孔以致假陽性增多。③血清標本處理不當，如標本嚴重溶血、脂血［2，3］，未除去細胞成分、纖維蛋白原、膽紅素、血紅蛋白及血液黏度過大等，可出現孔底由點變藍的跳孔現象，此標本重復實驗結果往往是陰性。④廠家試劑質量的變化造成。
2 對策
2． 1 檢查試劑實驗前檢查試劑的組分和批號，確認試劑未過期，以及確認所有組分均屬于對應的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。嚴格按說明書的步驟操作，錯加、漏加試劑組分將會出現白板的異常結果。加完試劑后可觀察一下液面高度是否一致，以減少漏加現象。疊氮鈉等酶抑制物會使HRP 酶標失活，應確認盛酶標的容器不含酶抑制物［4］，確認配制洗液的容器已洗干凈，確認配制洗液的純化水達到要求且未受污染。
2． 2 試劑平衡從低溫冰箱中取出的試劑，打開試劑盒，取出各組分，在室溫平衡30 min 以上，才能開啟各組分包裝，開始使用。試劑的平衡方式、時間和效果，將直接影響試劑對弱陽性標本的檢出能力。確定所使用的每個試劑體積正確，加入時間適當。孵育時間、孵育溫度、洗板次數和浸泡時間嚴格按說明書要求去做。
2． 2． 1 防腐劑選擇酶聯免疫實驗中的標本禁用疊氮鈉作為防腐劑，可選用Proclin、硫柳汞等其他防腐劑，如懷疑實驗有問題，可復檢。
2． 2． 2 質控品或標本要求質控品從冰箱中取出時要室溫平衡30 min 以上，使用前反復搖勻，不要劇烈振蕩。確認孵育的溫度及孵育時間是否達到要求。質控品或標本避免反復凍融，標本的反復凍融所產生的機械剪切力將對標本中的蛋白分子產生破壞作用，從而引起假陰性結果。如標本在保存過程中出現細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉淀后取上清液檢查。質控品使用1 周就要更換，避免細菌污染對結果產生影響。一旦發現結果偏高或偏低，馬上查找原因，如有必要及時更換新的質控品。選用臨界值血清做室內質控可防止因弱陽性引發的標本漏檢［5］。為減少質控品批號變換造成的影響，適當增大同一批號的試劑和質控品的庫存量( 4～ 5個月為宜) ［6］。標本在1 周內使用的可儲存在2～ 8℃冰箱里，如需長期保存，應置于－ 20℃以下保存，質控品應小量分裝，并置－ 20℃以下保存。重新設定酶標儀的參數。
2． 2． 3 檢查濾光片是否匹配設備老化( 酶標儀的光源、光電轉換器的老化衰退等) 是影響結果的一個重要原因。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，使用前先預熱儀器15～ 30 min，測讀結果更穩定。比色前根據實驗項目的不同選擇不同波長的濾光片，現在酶聯免疫吸附試驗一般采用雙波長( 450 nm/630 nm) 的濾光片來比色，雙波長比色測定具有能排除有微滴板本身、板孔內標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的特點。不按說明書要求選擇濾光片會得出錯誤的結果。在使用雙波長進行結果判讀時，不應再設空白對照，以免出現假陰性結果［7］。
2． 3 靈敏度過高、板底高、高背景解決辦法
2． 3． 1 嚴格操作實驗前檢查試劑的組分和批號，確認試劑未過期，以及確認所有組分均屬于對應的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。避免試劑組分間的交叉污染，確保吸頭、容器的干凈。顯示劑使用前避光保存，孵育時間、孵育溫度、洗板次數和浸泡時間嚴格按說明書要求去做。
2． 3． 2 洗板注意事項加標本時盡量避免交叉污染，如盛標本的試管周圍有血痂，易脫落，應遠離酶標板。手工洗板時前3 次注滿洗液后立即棄去，后幾次再設定浸泡時間，可減少交叉污染。疏通洗板機加液頭，使洗板時每孔均注滿洗液。洗板完后拍板時應用合適的吸水紙巾，應注意不要把無關物質拍進板孔，并盡量不要在同位置拍，以免交叉污染。
2． 4 試劑靈敏度高質量的標本前處理，是保證血液ELISA 自動化檢驗質量的重要前提［8］。拒收溶血、受細菌污染的不合格樣品，否則細菌和紅細胞中過氧化酶的作用可使結果出現假陽性［9］。脂濁對ELISA 的影響主要考慮脂濁造成血清黏度大，分子運動速度減慢，減少抗原抗體結合的概率或由于乳糜微粒產生的屏蔽效應而對測定結果產生負干擾［10］。標本用3000 r /min 離心15 min，完全分離血清后再作實驗［11］。Cutoff 值計算公式應嚴格參照說明書，每種試劑的Cutoff 值計算公式不盡相同。調整洗板機時，應注意儀器標示的液量與實際液量并不相符，應根據實踐情況調整注滿每孔。當國家標準要求提高靈敏度時，廠家試劑的靈敏度也相應提高，假陽性也有所上升，但只要在合理范圍，是可以接受的。ELISA 檢測影響因素很多，上述只是一些常見因素分析，要想提高ELISA 檢測的檢測質量，關鍵還要加強實驗室科學管理，強化標準化流程操作，加強質量控制，提高人員素質，減少檢測假陽性、假陰性結果的發生。
參考文獻
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注明：本文摘自陳成進在《醫學綜述》發表的文章，如有侵權，請聯系我們。